离心技术的基础理论

1.离心技术的基础理论

（1）离心式冷水机组工作原理

离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯生物样品的一种方法。悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而使溶液得以分离，颗粒的沉降速度取决于离心机的转速、颗粒的质量、大小和密度。

当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用可使得悬浮的颗粒逐渐下沉，颗粒越重，下沉越快。微粒在重力场下移动的速度与微粒的大小、形态、密度、重力场的强度及液体的黏度有关。如红细胞颗粒，直径为数微米，可以在通常重力作用下观察到它们的沉降过程。此外，物质在介质中沉降时还伴随有扩散现象（扩散是由于微粒的热运动而产生的质量迁移现象,主要是由于密度差引起的）。对小于几微米的微粒如病毒或蛋白质等，它们在溶液中成胶体或半胶体状态，仅仅利用重力是不可能观察到沉降过程的，因为颗粒越小沉降越慢，而扩散现象则越严重。扩散现象是不利于样品分离的，如果加大重力，就可能克服扩散现象的不利影响,实现生物大分子的分离。离心机就是利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力，迫使液体中微粒克服扩散加快沉降速度，把样品中具有不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。

（2）离心力与相对离心力

离心力：当物体所受外力小于运动所需要的向心力时，物体将向远离圆心的方向运动。物体远离圆心运动的现象称为离心现象也叫离心运动。离心运动是由于向心力消失或不足而造成的。

相对离心力：是指在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度"g"。

（3）液体中的微粒在重力场中的分离

重力沉降：液体中的微粒受重力的作用，较重的微粒下沉与液体分开，这个现象称为重力沉降。

沉降速度：指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。

沉降时间：在实际工作中，常常遇到要求在已有的离心机上把某一种溶质从溶液中全部沉降分离出来需用多大转速与多长时间可达到目的的问题。如果转速已知，则需确定分离某粒子所需的时间即沉降时间。

（4）液体中的微粒在重力场中的沉降

①当离心机开动时，离心管绕离心转头的轴旋转，作圆周运动（见图3-1），在离心管内的样品颗粒将同样运动；②假如颗粒是处于真空中（即没有介质阻力时），颗粒会沿切线方向飞去，也就是当离心管由0位转到1位时，颗粒到达离心管底部A位。对于离心管而言，样品颗粒由顶位移到了A位，也就是由离心管顶部移到了底部，这与重力场中的由高处落到低处相似。这种颗粒在圆周运动时的切线运动称为离心沉降；③颗粒作切线运动时将由于介质的摩擦阻力，使其在离心管中依图3-1中虚线所示的曲线运动，当离心管由0位转到2位时，颗粒由顶位移到B位。介质的阻力越大，颗粒在离心管中沉降速度越小，沉降的距离也越短。旋转速度越大，颗粒在离心管中沉降越快。

2常用的离心方法

(1)差速离心法(又称分步离心法)采用不同的离心速度和离心时间,使沉降速度不同的颗粒分步离心的方法,称为差速离心。操作时,将含有两种不同颗粒的混悬液,以常速离心，使大的颗粒下沉，将上清液倾倒于另一离心管中，再加大离心力，离心一定时间，分离小的颗粒，反复多次分离，达到分离目的。差速离心主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。差速离心法的优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子；分离时间短、重复性高；样品处理量大。缺点是：分辨率有限、分离效果差，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，不能一次得到纯颗粒；壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀；颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。

(2)密度梯度离心法(又称区带离心法)该法又分为速率区带离心法和等密度区带离心法。样品在一定惰性梯度介质中进行离心沉淀或沉降平衡，在一定离心力下把颗粒分配到梯度液中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。该法的优点是：具有很好的分辨率，分离效果好，可一次获得较纯颗粒；适用范围广，既能分离沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。缺点是：离心时间较长；需要制备梯度液；操作严格，不宜掌握。

①速率区带离心法：是根据分离的粒子在离心力作用下，在梯度液中沉降速度的不同，离心后具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内形成几条分开的样品区带，达到彼此分离的目的。临床常使用的分离液是Ficoll、Percoll及蔗糖。把静脉血中单个核细胞分离出来，前一种分离液将血液中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）分为一个层，同时提出。而Percoll分离液将血中淋巴细胞和单核细胞分为二个梯度层，分别提取。后者分离效果优于前者，但操作繁琐。

②等密度区带离心法：当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直沿梯度移动到它们密度恰好相等的位置上（即等密度点）形成区带，称为等密度区带离心法。等密度区带离心的有效分离取决于颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒的大小和形状无关，但后两者决定着达到平衡的速率、时间和区带的宽度。

（3)分析性超速离心法

①分析型超速离心机的工作原理：分析型超速离心机主要由一个椭圆形的转子、一套真空系统和一套光学系统所组成。该转子通过一个柔性的轴连接成一个高速的驱动装置，此轴可使转子在旋转时形成自己的轴。转子在一个冷冻的真空腔中旋转，其容纳两个小室：分析室和配衡室。分析室的容量一般为1ml，呈扇形排列在转子中，其工作原理与一个普通水平转子相同。分析室有上下两个平面的石英窗，离心机中装有的光学系统可保证在整个离心期间都能观察小室中正在沉降的物质，可以通过对紫外光的吸收（如对蛋白质和DNA）或折射率的不同对沉降物进行监测。在分析室中物质沉降时重粒子和轻粒子之间形成的界面就像一个折射的透镜，结果在检测系统的照相底板上产出一个"峰"，由于沉降不断进行，界面向前推进，故"峰"也在移动，从峰移动的速度可以得到物质沉降速度的指标。

②分析性超速离心法的应用范围：测定生物大分子的相对分子重量。测定相对分子重量中应用最广的是沉降速度法，用照相记录，即可求出粒子的沉降系数。生物大分子的纯度估计。分析型超速离心机已广泛地应用于研究DNA制剂、病毒和蛋白质的纯度。分析生物大分子中的构象变化。可以通过检查样品在沉降速度上的差异来证实。

3离心机的分类与结构

（1）离心机的分类国际上对离心机的分类方法有三种，按用途分、按转速分、按结构分。按用途可分为制备型、分析型和制备分析两用型；按转速分类可分为低速、高速、超速等离心机；按结构可分为台式、多管微量式、细胞涂片式、血液洗涤式、高速冷冻式、大容量低速冷冻式、台式低速自动平衡离心机等。

（2）低速离心机它主要用作血浆、血清的分离及脑脊液、胸腹水、尿液等有形成份的分离；高速离心机：它主要用于临床实验室分子生物学中的DNA、RNA的分离和基础实验室对各种生物细胞、无机物溶液、悬浮液及胶体溶液的分离、浓缩、提纯样品等；超速离心机：超速离心机按用途分为制备型、分析型及分析制备两用型三种。制备型超速离心机主要用于生物大分子、细胞器和病毒等的分离纯化，能使亚细胞器分级分离，并可用于测定蛋白质及核酸的分子量；分析型超速离心机装有光学系统，可拍照、测量、数字输出、打印自动显示系统等，可以通过光学系统对测试样品的沉降过程及纯度进行观察。

（3）专用离心机

①免疫血液离心机:用于临床输血、血型鉴定、交叉配血、淋巴细胞分离、血小板分离以及抗人球蛋白试验等。

②微量毛细管离心机:用于血溶比试验，微量血细胞比积以及放射性核素微量标记物的测定。

③尿沉渣分离离心机:用于尿液中有形成分的分离与尿液工作站相配套。

④细胞涂片离心机:用于脑脊液、胸腹水的脱落细胞的分离及涂片。

（4）低速离心机、高速（冷冻）离心机及超速（冷冻）离心机的结构:①低速离心机的结构由电动机、离心转盘（转头）、调速器、定时器、离心套管与底座等主要部件构成。②高速（冷冻）离心机的结构由转动装置、速度控制系统、温度控制系统、真空系统、离心室、离心转头及安全保护装置等。③超速(冷冻)离心机主要由驱动和速度控制、温度控制、真空系统和转头四部分组成。

（5）离心转头的分类应用及功能：离心机转头一般可分为五大类有①固定角转头②甩平式转头③连续流动转头④区带转头⑤垂直转头。

（6）离心机的主要技术参数及性能指标：主要参数包括：最大转速；最大离心力；最大容量；电源功率；温度控制范围；工作电压；调速范围。离心机转头的常用标记及转头参数。离心机转头的常用标记是由三部分组成，第一部分为英文字母符号；第二部分为数字；第三部分为标识转头由不同的金属组成。转头参数有，Rmax、Rmin、RCFmax、RCFmin、RPMmax、Ｋ等。

4离心机的应用和维护

（1）离心方法的选择:选择合适的离心转速和离心时间，就能达到较好的分离效果。①若样品中存在两种以上质量和密度不同的样品颗粒，可采用差速离心法。②对于有密度梯度差异的样品介质，可采用密度梯度离心法。③若不同样品颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内，离心时密度不同的物质颗粒因浮力差异或向下沉降，或向上漂浮，一直移到它们各自密度恰好对应的位置（等密度点），形成区带。可采用等密度梯度离心。

（2）离心时间以及温度和pH值的确定

离心时间：依据离心方法的不同有所差别。①差速离心是指某种颗粒完全沉降到离心管底的时间。②等密度梯度离心是指颗粒完全到达等密度点的平衡时间。③密度梯度离心所需的离心时间则是指形成界限分明的区带的时间。

温度和pH值：为了防止欲分离物质的凝集、变性和失活，除了在离心介质的选择方面加以注意外，还必须控制好温度及介质溶液的pH值等离心条件。离心温度一般控制在40C左右，对于某些热稳定性较好的酶等，也可以在室温下进行。

（3）离心机的使用、维护：各类离心机因其转速高，产生的离心力大，使用不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用离心机时都必须严格遵守操作规程。

（4）离心机常见故障及排除方法：①电机不转②转头的损坏③机体震动剧烈、响声异常。有许多故障为不正确操作所致，正确操作可减少或消除故障。在工作过程中，如出现任何异常现象均应立即停机，检查原因，不得强行运转，以免产生不必要的损失。

5离心方法和离心机的进展

离心机的类型也越来越新颖,伊朗正在对将拥有更强力的转子，旋转速度更快，浓缩能力更强的P2离心机展开研究；俄罗斯立萨马拉医科大学的专家，已研制出了使下肢骨折患者更快地康复的新型医用离心机并用于临床治疗；国内的一种结构简单、操作方便、适应性强、安装使用维修方便、分离时颗粒不易破坏的ＳＳ型三足式离心机已广泛应用于各行业和科研实验室。

目前，离心方法已逐渐走向规范化、标准化、专业化。各种专用离心机，对所分离样品由计算机自动控制程序设定了一定的转速、相对离心力及离心时间等。

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